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Microscopios de laboratorio

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Función del microscopio óptico

Un microscopio (del griego antiguo: μικρός, mikrós, “pequeño” y σκοπεῖν, skopeîn, “mirar” o “ver”) es un instrumento utilizado para ver objetos que son demasiado pequeños para ser vistos a simple vista. La microscopía es la ciencia de la investigación de pequeños objetos y estructuras usando tal instrumento. Los medios microscópicos son invisibles para el ojo a menos que sean ayudados por un microscopio.

Hay muchos tipos de microscopios y se pueden agrupar de diferentes maneras. Una forma es describir la forma en que los instrumentos interactúan con una muestra para crear imágenes, ya sea enviando un rayo de luz o electrones a una muestra en su trayectoria óptica, o escaneando a una corta distancia de la superficie de una muestra usando una sonda. El microscopio más común (y el primero en ser inventado) es el microscopio óptico, que utiliza la luz para pasar a través de una muestra para producir una imagen. Otros tipos principales de microscopios son el microscopio de fluorescencia, el microscopio electrónico (tanto el microscopio electrónico de transmisión como el microscopio electrónico de barrido) y los diversos tipos de microscopios con sonda de barrido.

Historia del microscopio óptico

Aunque los objetos que se parecen a lentes datan de 4000 años y existen relatos griegos de las propiedades ópticas de las esferas llenas de agua (siglo V aC) seguidos de muchos siglos de escritos sobre óptica, el uso más antiguo conocido de microscopios simples (lupas) se remonta a el uso generalizado de lentes en anteojos en el siglo XIII.

Los primeros ejemplos conocidos de microscopios compuestos, que combinan una lente objetivo cerca del espécimen con un ocular para ver una imagen real, aparecieron en Europa alrededor de 1620. El inventor es desconocido, aunque se han hecho muchas afirmaciones a lo largo de los años. Varios giran en torno a los centros de fabricación de gafas en los Países Bajos, incluyendo afirmaciones de que fue inventado en 1590 por Zacharias Janssen (reclamación hecha por su hijo) y / o el padre de Zacharias, Hans Martens, afirma que fue inventado por su el fabricante de gafas vecino y rival, Hans Lippershey (que solicitó la primera patente de telescopio en 1608), y afirma que fue inventada por el expatriado Cornelis Drebbel, quien notó tener una versión en Londres en 1619.

Galileo Galilei (también citado a veces como inventor del microscopio compuesto) parece haber descubierto después de 1610 que podía enfocar su telescopio para ver objetos pequeños y, después de ver un microscopio compuesto construido por Drebbel en Roma en 1624, construyó su propia versión mejorada. Giovanni Faber acuñó el nombre de microscopio para el microscopio compuesto que Galileo envió a la Accademia dei Lincei en 1625 (Galileo lo había llamado el “occhiolino” o “ojo pequeño”).

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Aumento de los microscopios de luz modernos

La primera descripción detallada de la anatomía microscópica del tejido orgánico basada en el uso de un microscopio no apareció hasta 1644, en L’occhio della mosca de Giambattista Odierna, o The Fly’s Eye.

El microscopio fue en gran medida una novedad hasta las décadas de 1660 y 1670 cuando los naturalistas de Italia, los Países Bajos e Inglaterra comenzaron a utilizarlos para estudiar la biología, los organismos y su ultraestructura. El científico italiano Marcello Malpighi, llamado el padre de la histología por algunos historiadores de la biología, comenzó su análisis de las estructuras biológicas con los pulmones.

Micrographia de Robert Hooke tuvo un gran impacto, en gran parte debido a sus impresionantes ilustraciones. Una contribución significativa vino de Antonie van Leeuwenhoek quien logró hasta 300 aumentos usando un simple microscopio de lente única. Metió una pequeña lente de bola de vidrio entre los agujeros en dos placas de metal remachadas juntas, y con una aguja ajustable por tornillos para montar la muestra. Luego, Van Leeuwenhoek redescubrió glóbulos rojos (después de Jan Swammerdam) y espermatozoides, y ayudó a popularizar el uso de microscopios para ver la ultraestructura biológica. El 9 de octubre de 1676, van Leeuwenhoek informó sobre el descubrimiento de microorganismos.

El rendimiento de un microscopio óptico depende de la calidad y el uso correcto del sistema de lentes condensador para enfocar la luz en la muestra y el objetivo para capturar la luz del espécimen y formar una imagen. Los primeros instrumentos fueron limitados hasta que este principio fue totalmente apreciado y desarrollado desde finales del siglo XIX hasta principios del siglo XX, y hasta que las lámparas eléctricas estuvieron disponibles como fuentes de luz.

En 1893, August Köhler desarrolló un principio clave de iluminación de muestra, la iluminación Köhler, que es fundamental para alcanzar los límites teóricos de resolución para el microscopio óptico. Este método de iluminación de muestra produce una iluminación uniforme y supera el contraste y la resolución limitados impuestos por las primeras técnicas de iluminación de muestra. Desarrollos adicionales en la iluminación de la muestra vinieron del descubrimiento del contraste de fase por Frits Zernike en 1953, y la iluminación de contraste de interferencia diferencial por Georges Nomarski en 1955; ambos permiten la obtención de imágenes de muestras transparentes no teñidas.

Microscopios electrónicos

A principios del siglo XX, se desarrolló una alternativa significativa al microscopio óptico, un instrumento que utiliza un rayo de electrones en lugar de luz para generar una imagen. El físico alemán, Ernst Ruska, que trabaja con el ingeniero eléctrico Max Knoll, desarrolló el primer prototipo de microscopio electrónico en 1931, un microscopio electrónico de transmisión (TEM). El microscopio electrónico de transmisión funciona en principios similares a un microscopio óptico, pero utiliza electrones en lugar de luz y electroimanes en lugar de lentes de vidrio. El uso de electrones, en lugar de luz, permite una resolución mucho mayor.

El desarrollo del microscopio electrónico de transmisión fue seguido rápidamente en 1935 por el desarrollo del microscopio electrónico de barrido por Max Knoll.  Aunque los TEM se utilizaron para la investigación antes de la Segunda Guerra Mundial, y se popularizaron después, el SEM no estuvo disponible comercialmente hasta 1965.

Los microscopios electrónicos de transmisión se hicieron populares después de la Segunda Guerra Mundial. Ernst Ruska, trabajando en Siemens, desarrolló el primer microscopio electrónico de transmisión comercial y, en la década de 1950, comenzaron a celebrarse importantes conferencias científicas sobre microscopía electrónica. En 1965, el primer microscopio electrónico de escaneo comercial fue desarrollado por el profesor Sir Charles Oatley y su estudiante de postgrado Gary Stewart, y comercializado por Cambridge Instrument Company como el “Stereoscan”.

Uno de los últimos descubrimientos sobre el uso de un microscopio electrónico es la capacidad de identificar un virus. [18] Dado que este microscopio refleja una imagen clara y visible de pequeños orgánulos, entonces en un microscopio electrónico no habrá necesidad de reactivos para ver el virus o las células dañinas, lo que resulta en una forma más eficiente para la detección de patógenos.

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Microscopios de sonda de exploración

De 1981 a 1983, Gerd Binnig y Heinrich Rohrer trabajaron en IBM en Zurich, Suiza para estudiar el fenómeno del túnel cuántico y finalmente crear un instrumento práctico, un microscopio de exploración de la teoría del túnel cuántico que lee fuerzas muy pequeñas intercambiadas entre una sonda y la superficie de una muestra. La sonda casi se encuentra con la superficie tan de cerca que los electrones de un experimento pueden tener un flujo continuo de electrones, haciendo que la corriente entre la superficie y la sonda.

El microscopio inicialmente no fue bien recibido debido a la naturaleza compleja de las explicaciones teóricas subyacentes. En 1984 Jerry Tersoff y D.R. Hamann estuvo en los laboratorios Bell de AT & T en Murray Hill, New Jersey comenzó a publicar artículos que relacionaban los resultados teóricos con los experimentales obtenidos por el instrumento. Esto fue seguido de cerca en 1985 con instrumentos comerciales en funcionamiento, y en 1986 con Gerd Binnig, Quate y la invención de Gerber del microscopio de fuerza atómica, luego el Premio Nobel de Física de Binnig y Rohrer para la SPM.

Los tipos de microscopio de sonda de exploración se han seguido desarrollando a medida que avanza la capacidad de mecanizar sondas y puntas ultrafinas.

Microscopios de fluorescencia

Los desarrollos más recientes en el microscopio óptico se centran en gran medida en el aumento de la microscopía de fluorescencia en biología. Durante las últimas décadas del siglo XX, particularmente en la era post-genómica, se desarrollaron muchas técnicas para la tinción fluorescente de estructuras celulares. Los principales grupos de técnicas implican tinción química dirigida de estructuras celulares particulares, por ejemplo, el compuesto químico DAPI para marcar el ADN, el uso de anticuerpos conjugados con indicadores fluorescentes, ver inmunofluorescencia y proteínas fluorescentes, como la proteína verde fluorescente.  Estas técnicas utilizan estos fluoróforos diferentes para el análisis de la estructura celular a nivel molecular en muestras tanto vivas como fijas.

El aumento de la microscopía de fluorescencia impulsó el desarrollo de un importante diseño de microscopio moderno, el microscopio confocal. El principio fue patentado en 1957 por Marvin Minsky, aunque la tecnología láser limitó la aplicación práctica de la técnica. No fue sino hasta 1978 cuando Thomas y Christoph Cremer desarrollaron el primer microscopio confocal de escaneo láser y la técnica ganó popularidad rápidamente a través de la década de 1980.

Microscopios de superresolución

Gran parte de la investigación actual (a principios del siglo XXI) sobre técnicas de microscopía óptica se centra en el desarrollo de análisis de superresolución de muestras marcadas con fluorescencia. La iluminación estructurada puede mejorar la resolución entre dos y cuatro veces y las técnicas como el microscopio de reducción de emisiones estimulada (STED) se están acercando a la resolución de los microscopios electrónicos.

Esto ocurre porque el límite de difracción se produce a partir de la luz o la excitación, lo que hace que la resolución se duplique para volverse súper saturada. Stefan Hell fue galardonado con el Premio Nobel de Química 2014 por el desarrollo de la técnica STED, junto con Eric Betzig y William Moerner, que adaptaron microscopía de fluorescencia para viusalization de una sola molécula.

Microscopios de rayos X

Los microscopios de rayos X son instrumentos que usan radiación electromagnética generalmente en la banda de rayos X blandos para representar objetos. Los avances tecnológicos en la óptica de las lentes de rayos X a principios de la década de 1970 convirtieron al instrumento en una opción de imagen viable.

A menudo se utilizan en la tomografía (ver tomografía microcomputada) para producir imágenes tridimensionales de objetos, incluidos materiales biológicos que no se han fijado químicamente. Actualmente se están realizando investigaciones para mejorar la óptica para rayos X duros que tienen mayor poder de penetración.

Partes del microscopio óptico

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Cómo utilizar un microscopio escolar paso a paso

En este vídeo vas a aprender a utilizar el microscopio escolar. Podrás ver cómo se enfoca, cómo son las muestras y cómo conseguir una imagen nítida.

Tipos de microscopio

Los microscopios se pueden separar en varias clases diferentes. Una agrupación se basa en lo que interactúa con la muestra para generar la imagen, es decir, luz o fotones (microscopios ópticos), electrones (microscopios electrónicos) o una sonda (microscopios de sonda de barrido). Alternativamente, los microscopios pueden clasificarse en si analizan la muestra a través de un punto de escaneo (microscopios ópticos con focales, microscopios electrónicos de barrido y microscopios con sonda de barrido) o analizan la muestra de una sola vez (microscopio óptico de campo amplio y microscopios electrónicos de transmisión).

Los microscopios ópticos de campo amplio y los microscopios electrónicos de transmisión usan la teoría de lentes (óptica para microscopios ópticos y lentes electromagnéticas para microscopios electrónicos) para magnificar la imagen generada por el paso de una onda transmitida a través de la muestra o reflejada por la muestra. Las ondas utilizadas son electromagnéticas (en microscopios ópticos) o haces de electrones (en microscopios electrónicos). La resolución en estos microscopios está limitada por la longitud de onda de la radiación utilizada para obtener imágenes de la muestra, donde las longitudes de onda más cortas permiten una resolución más alta.

Los microscopios óptico y electrónico de barrido, como el microscopio con focal y el microscopio electrónico de barrido, usan lentes para enfocar una mancha de luz o electrones en la muestra y luego analizan las señales generadas por el haz que interactúa con la muestra. El punto luego se escanea sobre la muestra para analizar una región rectangular. La ampliación de la imagen se logra al mostrar los datos del escaneo de un área de muestra físicamente pequeña en una pantalla relativamente grande. Estos microscopios tienen el mismo límite de resolución que los microscopios ópticos, de sonda y electrónicos de campo amplio.

Los microscopios de sonda de barrido también analizan un único punto en la muestra y luego exploran la sonda sobre una región de muestra rectangular para construir una imagen. Como estos microscopios no usan radiación electromagnética o de electrones para obtener imágenes, no están sujetos al mismo límite de resolución que los microscopios óptico y electrónico descritos anteriormente.

Microscopio Óptico

El tipo más común de microscopio (y el primero inventado) es el microscopio óptico. Este es un instrumento óptico que contiene una o más lentes que producen una imagen ampliada de una muestra colocada en el plano focal. Los microscopios ópticos tienen vidrio refractivo y ocasionalmente plástico o cuarzo, para enfocar la luz hacia el ojo u otro detector de luz. Los microscopios ópticos basados ​​en espejo operan de la misma manera. La ampliación típica de un microscopio óptico, suponiendo una luz de rango visible, es de hasta 1250x con un límite de resolución teórico de alrededor de 0,250 micras o 250 nanómetros.

Esto limita el límite de aumento práctico a ~ 1500x. Las técnicas especializadas (por ejemplo, microscopía confocal de barrido, Vertico SMI) pueden exceder este aumento, pero la resolución es limitada por difracción. El uso de longitudes de onda de luz más cortas, como el ultravioleta, es una forma de mejorar la resolución espacial del microscopio óptico, al igual que los dispositivos como el microscopio óptico de exploración de campo cercano.

Sarfus, una técnica óptica reciente aumenta la sensibilidad del microscopio óptico estándar hasta el punto de que es posible visualizar directamente películas nanométricas (hasta 0.3 nanómetros) y nanoobjetos aislados (hasta 2 nm de diámetro). La técnica se basa en el uso de sustratos no reflectantes para la microscopía de luz reflejada por polarización cruzada.

La luz ultravioleta permite la resolución de las características microscópicas, así como a las muestras de imágenes que son transparentes para el ojo. La luz infrarroja cercana se puede utilizar para visualizar circuitos integrados en dispositivos de silicio unidos, ya que el silicio es transparente en esta región de longitudes de onda.

En la microscopía de fluorescencia, muchas longitudes de onda de luz, desde ultravioleta a visible, se pueden utilizar para hacer que las muestras emitan fluorescencia para permitir su visualización a simple vista o con el uso de cámaras específicamente sensibles.

La microscopía de contraste de fase es una técnica de iluminación de microscopía óptica en la que pequeños cambios de fase en la luz que pasa a través de una muestra transparente se convierten en cambios de amplitud o contraste en la imagen. El uso del contraste de fase no requiere tinción para ver la diapositiva. Esta técnica de microscopio permitió estudiar el ciclo celular en células vivas.

El microscopio óptico tradicional evolucionó más recientemente al microscopio digital. Además de, o en lugar de, ver directamente el objeto a través de los oculares, se utiliza un tipo de sensor similar a los utilizados en una cámara digital para obtener una imagen, que luego se muestra en un monitor de computadora. Estos sensores pueden usar CMOS o tecnología de dispositivo de carga acoplada (CCD), dependiendo de la aplicación.

La microscopía digital con niveles de luz muy bajos para evitar el daño a muestras biológicas vulnerables está disponible usando cámaras digitales sensibles al conteo de fotones. Se ha demostrado que una fuente de luz que proporciona pares de fotones entrelazados puede minimizar el riesgo de daño a las muestras más sensibles a la luz. En esta aplicación de imágenes fantasma a microscopía escasa de fotones, la muestra se ilumina con fotones infrarrojos, cada uno de los cuales se correlaciona espacialmente con un compañero enredado en la banda visible para obtener imágenes eficaces mediante una cámara de conteo de fotones.

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Microscopio electrónico

Los dos tipos principales de microscopios electrónicos son los microscopios electrónicos de transmisión (TEM) y los microscopios electrónicos de barrido (SEM).  Ambos tienen una serie de lentes electromagnéticas y electrostáticas para enfocar un haz de electrones de alta energía en una muestra. En un TEM, los electrones pasan a través de la muestra, de forma análoga a la microscopía óptica básica.

Esto requiere una preparación cuidadosa de la muestra, ya que la mayoría de los materiales dispersan fuertemente a los electrones. Las muestras también deben ser muy delgadas (50-100 nm) para que los electrones puedan atravesarla. Las secciones transversales de las células teñidas con osmio y metales pesados ​​revelan membranas y proteínas de organelas claras como los ribosomas. Con un nivel de resolución de 0,1 nm, se pueden obtener vistas detalladas de virus (20-300 nm) y una cadena de ADN (2 nm de ancho).

Por el contrario, el SEM tiene bobinas de trama para escanear la superficie de objetos a granel con un fino haz de electrones. Por lo tanto, la muestra no necesariamente necesita ser seccionada, sino que requiere un recubrimiento con una sustancia tal como un metal pesado. Esto permite vistas tridimensionales de la superficie de las muestras.

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Microscopio de sonda de exploración

Los diferentes tipos de microscopios de sonda de barrido surgen de los diferentes tipos de interacciones que se producen cuando una pequeña sonda de algún tipo se escanea e interactúa con una muestra. Estas interacciones o modos se pueden registrar o mapear como función de la ubicación en la superficie para formar un mapa de caracterización. Los tres tipos más comunes de microscopios con sonda de exploración son los microscopios de fuerza atómica (AFM), los microscopios ópticos de exploración de campo cercano (MSOM o SNOM, microscopía óptica de exploración de campo cercano) y los microscopios de exploración de túneles (STM).

Un microscopio de fuerza atómica tiene una sonda fina, generalmente de silicio o nitruro de silicio, unida a un voladizo; la sonda se escanea sobre la superficie de la muestra y se miden y mapean las fuerzas que causan una interacción entre la sonda y la superficie de la muestra. Un microscopio óptico de exploración de campo cercano es similar a un AFM pero su sonda consiste en una fuente de luz en una fibra óptica cubierta con una punta que generalmente tiene una abertura para que pase la luz.

El microscopio puede capturar luz transmitida o reflejada para medir propiedades ópticas muy localizadas de la superficie, comúnmente de una muestra biológica. Los microscopios de exploración de túneles tienen una punta de metal con un solo átomo apical; la punta está unida a un tubo a través del cual fluye una corriente. La punta se escanea sobre la superficie de una muestra conductora hasta que fluye una corriente de túnel; la corriente se mantiene constante por el movimiento de la punta y una imagen se forma por los movimientos registrados de la punta.

Otros tipos de microscopios

Los microscopios acústicos de escaneo usan ondas de sonido para medir las variaciones en la impedancia acústica. Similar a Sonar en principio, se utilizan para trabajos tales como la detección de defectos en las subsuperficies de materiales, incluidos los que se encuentran en los circuitos integrados. El 4 de febrero de 2013, los ingenieros australianos construyeron un “microscopio cuántico” que proporciona una precisión sin igual.

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